Полимеразная цепная реакция

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

В конце статьи см. словарь
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Специфичность и применение
ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике — для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ — вирусов папилломы человека; в пульмонологии — для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии — для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний — в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии — для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 — 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Проведение ПЦР
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Ход реакции
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 — 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 — 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 — 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 — 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 — 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 — 2 минут.
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 — 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию
Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой — позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.
Словарь
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота — биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.
РНК– рибонуклеиновая кислота — биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев — нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.
Нуклеоти́ды — основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию — адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) — гуанин, цитозиновый (C) — цитозин, тиминовый (Т) — тимин, урациловый (U) — урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов — A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа — A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК — рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Литература

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Метод полимеразной цепной реакции был открыт почти тридцать лет назад американским учёным по имени Кэрри Мюллис. Методика широко распространена в медицине в качестве диагностического инструмента, и суть её состоит в копировании участка ДНК при помощи специального фермента (полимеразы) искусственным путём в пробирке.

В каких областях медицины применяется этот метод?

Для чего выполняется копирование ДНК и как это может послужить медицине?
Данная методика позволяет:

  • Выделять и клонировать гены.
  • Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
  • Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.

Полимеразная цепная реакция применяется также в криминалистической практике.
На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.
В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

  • В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии, туберкулёза.
  • В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза, хламидиоза, микоплазменной инфекции, гарднереллеза, герпеса, гонореи.
  • В гастроэнтерологической практике.
  • В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции.
  • В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты, дифтерия, сальмонеллёз.

В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ, венерических заболеваний, туберкулёза, клещевого энцефалита).

Что происходит во время протекания реакции?

Сама реакция является химически несложной. Источником ДНК для реакции может послужить капля крови, волос, кусочек кожи, и т.д. В теории, для проведения реакции требуются нужные реагенты, пробирка, проба из биологического материала и источник тепла.
Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.
Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.
Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.
Существует:

  • Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
  • Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.

После завершения каждого цикла копирования, количество фрагментов нуклеиновой кислоты возрастает в геометрической прогрессии. Именно поэтому сам процесс называют «цепной реакцией».
Спустя тридцать — сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.
Для амплификации in vitro (в пробирке) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

1. Из исследуемого материала выделяют ДНК.
2. Добавляют ДНК в специальный раствор из нуклеотидов.
3. Нагревают раствор до температуры 90 — 95 градусов Цельсия, для того, чтобы белок ДНК свернулся.
4. Снижают температуру до 60 градусов.
5. При повторении циклов повышения-понижения температуры количество участков нуклеиновой кислоты возрастает.
6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Какие преимущества имеет данная диагностика?

  • Универсальность: для этого метода подходят любые образцы нуклеиновой кислоты.
  • Высокая специфичность: возбудитель имеет уникальные последовательности цепочек ДНК, которые свойственны именно ему. Поэтому результаты проведённой ПЦР будут достоверными, в них невозможно спутать ген одного возбудителя с геном другого возбудителя.
  • Чувствительность к наличию даже единичной молекулы возбудителя.

  • Маленький объем материала, нужного для исследования. Подойдет даже капля крови. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неонатологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.
  • Возможность определения вялотекущей, хронической инфекции, а не только острой.
  • Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве.

Какие недостатки имеет данная диагностика?

  • Если в материале, предназначенном для проведения ПЦР, находится ДНК не только живого возбудителя, но и погибшего – будет происходить амплификация обеих ДНК. Соответственно, лечение после диагностики может быть назначено не совсем верное. Через некоторое время лучше пройти контроль эффективности проведённого лечения.
  • Повышенная чувствительность к наличию микроорганизмов тоже может считаться, в некотором роде, недостатком. Ведь в норме в человеческом организме присутствует условно-патогенная микрофлора, то есть это микроорганизмы, которые живут в кишечнике, желудке, других внутренних органах. Эти микроорганизмы могут принести вред человеку только при определенных неблагоприятных условиях – несоблюдение гигиенических требований, загрязненная питьевая вода и т.д. ПЦР-методика амплифицирует ДНК даже этих микроорганизмов, хотя они и не приводят к патологии.
  • ПЦР разных тест-систем может показывать результаты, которые будут разниться между собой. Существует много модификаций данной методики: «вложенная», «ассиметричная», «инвертированная», «количественная» ПЦР и другие.

Метод ПЦР

Суть метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР — это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают «праймеры» (затравки) — синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК — двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

  1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) — 95°С — 1 или 2 минуты;
  2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) — 60°С (к примеру) — 1 минута;
  3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) — 72°С — 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

  1. амплификатора(или, как его еще называют, термоциклера);
  2. системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);
  3. системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
  4. ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
  5. вортекса;
  6. микроцентрифуги;
  7. набора автоматических дозаторов (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода — высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

  • диагностика инфекционных заболеваний
  • диагностика наследственных заболеваний
  • выявление мутаций
  • генотипирование
  • клеточные технологии
  • создание генетических паспортов

экология

  • мониторинг состояния окружающей среды
  • анализ продуктов питания
  • анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

  • идентификация личности
  • установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

  • Общая информация по организации ПЦР-лабораторий
  • Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР
  • Главная проблема лабораторий ПЦР
  • Классическая ПЦР-лаборатория
  • ПЦР в модификации FLASH
  • Расходные материалы в ПЦР-лаборатории
  • Нормативно-правовые документы по ПЦР

Информация для заказа

Наименование Объем Производство Метод Кат.Номер
PrecisionShuttle pTUNE Индуцируемый Вектор OriGene PS100021
Вода без нуклеаз R0582
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4117NSFS
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, удлиненные, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4137NSFS
Ноутбук с предустановленным специализированным программным обеспечением (для ДТ-96, ДТ-322, Джин-4, Джин) ДНК-Технология ПЦР в реальном времени I-PC/01
Устройство для запечатывания микропланшет»ДТпак» ДНК-Технология ПЦР в реальном времени O-DTPACK

Полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций желаемых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе). Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификации), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например для клонирования генов, введение мутаций, выделение новых генов, секвенирование, для создания и определения генетически модифицированных организмов, диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), идентификации малых количеств ДНК, установление отцовства.

История

Полимеразная цепная реакция была открыта Кэри Маллис. Он был награжден Нобелевской премией по химии 1993 года под это открытие, через семь лет после того, как он и его коллеги из компании Cetus предложили его для практического использования. Впервые метод был изобретен в 1983 году, во время работы Маллис в компании Cetus в городе Емеривиль (Калифорния), одной из первых биотехнологических компаний. Его задачей было создание коротких цепочек ДНК для других ученых. Маллис писал, что идея ПЦР пришла ему, когда он ночью в своем автомобиле ехал вдоль Калифорнийского шоссе 1. Он продумывал новый путь анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда осознал, что вместо этого он изобрел метод амплификации любого участка ДНК с помощью повторных циклов дублирования, которые осуществлял фермент ДНК-полимераза. В журнале Scientific American Маллис подвел подсумок метода: «Начиная с единой молекулы ДНК, носителя генетической информации, ПЦР может предоставить 100 000 000 000 подобных молекул за несколько часов. Реакцию очень легко провести, она требует одной тестовой трубки, незначительного количества реагентов, и источники тепла «.

Фермент ДНК-полимераза встречается естественно в живых организмах. В живых клетках он выполняет функции репликации ДНК в течение митоза и мейоза. Полимераза работает, связываясь с одной цепочкой ДНК и синтезируя другой, создавая двойную спираль. В первом прототипе процесса ПЦР, фермент использовался in vitro (в контролируемой окружении за пределами организма). Двухцепная молекула ДНК разделялась на отдельные цепочки с помощью нагрева до 94 ° C. Однако при этой температуре ДНК-полимераза, которая использовалась в то время, денатурувалася, поэтому фермент приходилось добавлять после стадии нагрева на каждом цикле реакции. Оригинальное процедура была очень неэффективна, так как требовала много времени, больших количеств ДНК-полимеразы, и непрерывного внимания в течение всего процесса.

Позже, этот оригинальный процесс ПЦР был значительно усовершенствован использованием ДНК-полимеразы, взятой из термофильных (теплолюбивых) бактерий, обычно растут в гейзерах при температуре выше 110 ° C. ДНК-полимераза, взятая из этих организмов, стойка при высоких температурах, и при использовании в ПЦР не повреждается при нагревании до необходимой температуры. С тех пор, как необходимость добавлять новую ДНК-полимеразы на каждом цикле исчезла, процесс копирования ДНК был упрощен и автоматизирован.

Одна из первых теплостойких ДНК-полимеразы была получена от бактерии Thermus aquaticus и стала известна под названием «Taq». Taq-полимераза широко используется для ПЦР и сейчас. Однако, ее недостатком является то, что из-за отсутствия механизма коррекции ошибок в 3 ‘→ 5’ направлении, она делает относительно большое количество ошибок при копировании ДНК, приводит к мутациям. Новые полимеразы, такие как Pwo или Pfu, полученные из архей, имеют такой механизм коррекции и могут значительно сократить число мутаций, которые встречаются в копируемых последовательности ДНК. Однако, эти ферменты полимеризуют ДНК гораздо медленнее, чем Taq. Сейчас доступны комбинации Taq и Pfu, обеспечивающих как высокую процесивнисть (протяженность участка, синтезируется за одно связывания фермента, и в результате скорость синтеза), так и высокую точность копирования ДНК.

ПЦР сейчас может выполняться на фрагментах ДНК размером более 10 kbp (тысяч пар оснований), но средний размер участка ДНК, амплифицируемого — от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований ДНК. Проблема с длинными фрагментами — в большом количестве ошибок и длинном времени реакции, поэтому необходимо поддерживать баланс между точностью и просесивнистю фермента. Обычно, чем дольше участок, тем выше вероятность ошибок.

Метод ПЦР был запатентован корпорацией Cetus, где работал Маллис, вскоре после его открытия. Использование Taq-полимеразы также было защищено патентами. Однако, произошло несколько высокопрофильных судебных процессов по этому методу, в частности неудачный судебный процесс, инициированный компанией DuPont. Фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году и сейчас имеет все права на ПЦР. Битва патентов на право использования фермента Taq-полимеразы все еще продолжается в нескольких юрисдикциях во всем мире между компаниями La Roche и Promega. Интересно, что компаниям удалось продлить права на ПЦР и Taq на время после окончания начального патента 28 марта 2005.

Принцип действия

Необходимые компоненты

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК с помощью ферментов in vitro (в искусственных условиях). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

С помощью ПЦР обычно могут быть амплифицированные относительно короткие (до 10 kbp) участки ДНК с известными концами, в отдельных случаях могут использоваться участки в 40kbp. Для проведения простейшей ПЦР нужны следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, то есть фрагмент ДНК, содержащий ту область, которую нужно амплифицировать.
  • Два праймеры, комплементарные концам необходимого фрагмента.
  • Термостабильная ДНК-полимераза.
  • Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
  • Буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивает периодическую и быструю смену температуры (охлаждение и нагрев) тестовых пробирок с раствором, обычно с точностью не менее 0,1 ° C.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами (короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований). Каждый из праймеров комплементарный одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец участка, амплифицируемого.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (T m) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина нуклеотидов праймера гибридизована с матрицей. T m можно примерно определить по формуле, где n X — количество нуклеотидов Х в праймеры. Если праймер короткий и T m мала, то праймер может оказаться частично комплементарным к другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления — оптимум действия полимеразы, активность которой обычно падает при температуре выше 80 ° C. Поэтому тщательный дизайн праймеров — необходимая задача, которую следует провести перед тем, как начинать ПЦР.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

  • близкие T m праймеров (отличия не более, чем на 5 ° C);
  • отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
  • желательно, чтобы на 3 ‘конце был гуанин или цитозин.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (см рисунок 2):

  1. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 ° C (или до 98 ° C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-10 мин., Чтобы цепи ДНК разделились. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.
  2. Когда цепи разошлись, температуру снижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом (англ. Annealing). Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4-5 ° С ниже их температуру плавления. Время стадии — 0,5-2 мин.
  3. ДНК-полимераза реплицирует матричный цепочку, используя праймер как затравку. Это так называемая стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Полимеразы Taq и Pfu, часто используемые активные за 72 ° C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины фрагмента амплифицируют. Средняя скорость элонгации — 1000 пар оснований в 1 мин. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечной фрагменты. Эта стадия длится 10-15 мин.

Методы ПЦР

  • Вложена ПЦР (англ. Nested PCR) — применяется для уменьшения доли побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицируют участок ДНК внутри продукта первой реакции.
  • Инвертированная ПЦР (англ. Inverse PCR) — используется в том случае, если известна только небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить фланкирующие последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезов ДНК рестриктазами с последующим лигированием. В результате известные фрагменты образуются на обоих концах неизвестной участка, после чего можно проводить обычную ПЦР.
  • ПЦР с обратной транскрипцией (или ОТ-ПЦР, англ. Reverse Transcription PCR, RT-PCR) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят транскрипцию молекулы РНК с помощью зворотнеи транскриптазы и получают комплементарную ДНК (кДНК). Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются определенные гены.
  • Асимметричная ПЦР (англ. Assymetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится по классическому сценарию, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
  • Количественная ПЦР (англ. Quantitative PCR, Q-PCR) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе. Этот метод обычно используется «в реальном времени» (Количественная ПЦР в реальном времени). При этом применяют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
  • Touchdown ПЦР (англ. Touchdown PCR) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифической гибридизации праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
  • Метод молекулярных колоний (или «ПЦР в геле», англ. Polony — PCR Colony) — полиакриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят термоциклування. В точках, содержащие ДНК, в которой подобраны праймеры, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
  • Геликазно-зависимая амплификация (англ. Helicase-dependent amplification) — подобная обычно является ПЦР, но реакция проходит при постоянной температуре. Для разъединения цепей ДНК используется геликазы вместо тепловой денатурации.
  • ПЦР с быстрой амплификации концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE) — амплификация матричной РНК (мРНК) с помощью известного фрагмента внутри этой молекулы.
  • ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 kbp и более). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процесивнистю (т.е. полимераза способна за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3′-5 ‘ендонуклеазною активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
  • Случайная амплификация полиморфной ДНК (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательностью организмы, например, различные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 — 25 bp). Этот праймер будет частично комплементарный случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и т.д.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
  • Мультиплексная ПЦР (англ. Multiplex PCR) — использование большого числа уникальных праймеров в одной реакции ПЦР для получения нескольких продуктов ПЦР разной длины. Такая реакция заменяет несколько отдельных реакций ПЦР, которые требовали бы большего количества реагентов и времени. Температуры отжига каждого из наборов праймеров должны быть оптимизированы, чтобы они могли правильно работать в пределах одной реакции. Кроме того, размеры участков ДНК, которые амплификуються, должны достаточно отличаться, чтобы их можно было различить с помощью гелевого электрофореза.

  • Мультиплексная амплификация проб с помощью лиґування (англ. En: Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) позволяет амплифицировать несколько участков ДНК с помощью одной пары праймеров.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна лишь частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые нуклеотиды. Например, последовательность праймера может быть такой:.ATH., Где Н заменяет собой A, T или C.

Использование

Изоляция генетического материала

Большая часть эффективности ПЦР находится в его способности легко изолировать специфические регионы последовательности ДНК из материала целого генома. Для многих методов нужен резервуар молекул ДНК, изолированных из специфического фрагмента ДНК, и использование ПЦР сделало все эти методы эффективными. Поскольку ПЦР также амплифицируют изолированный регион, метод требует очень маленьких количеств материала для анализа.

Секвенирование ДНК и выявления генетических болезней

Как только создан образец, в котором все молекулы происходят от единого региона ДНК, возможно осуществить секвенирование (установление последовательности) ДНК для определения неизвестной последовательности нуклеотидов фрагмента между двумя праймерами. Один из праймеров ПЦР обычно используется как якорь для метода Зангер, самого общего сейчас метода секвенирования. Этот метод обычно используется для диагностики генетических заболеваний; врач может подтвердить диагноз, наблюдая различия последовательности ДНК, которые, как известно, связаны с заболеванием.

Методы рекомбинации ДНК

Изоляция фрагмента ДНК позволяет проведение методов рекомбинантной манипуляции ДНК, которые привлекают вставку предоставленной последовательности ДНК к генетическому материалу другого организма (сейчас такие организмы известны как генетически измененные организмы, ГЗО или GMO). ПЦР часто используется для амплификации гена, который затем может быть вставлен в другой геном через соответствующий процесс рекомбинации или, обычнее, вставленный в вектор (например, плазмиду), который несет ДНК в целевом организме.

Использование в криминалистике и установления отцовства

Метод генетических отпечатков пальцев (англ. Genetic fingerprinting) — метод, используемый в криминалистике для идентификации человека, сравнивая ее ДНК с ДНК в данном образце. ПЦР конечно используемого для амплификации набора определенных регионов ДНК, о которых известно, что вони меняются в длине от человека к человеку. Комбинация длин всех этих регионов, которые затем разделяются с помощью гелевого электрофореза, создает «генетический отпечаток пальцев». С применением ПЦР теоретически нужна только одна молекула ДНК для определенной идентификации, хотя в отдельных случаях именно эта чувствительной увеличивает риск ошибок из-за возможного загрязнения, и амплификации в результате ДНК из внешних источников. Существует несколько методов генетических отпечатков Пильце, но все вони обычно используют гелевый электрофорез, после чего образец окрашивается с помощью етидиум бромида или других красителей, или наблюдается с помощью гибридизации с пробами ДНК с помощью Саузерн-блоттинг (англ. Southern blot).

На практике необходим образец генетического материала собирается с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т.д. Этот образец сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Поскольку есть небольшая вероятность, что в двух человек отпечатки окажутся похожими, этот метод чаще используется для доказательства невиновности подозреваемого.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применять, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Амплификация и измерения количества ДНК

Поскольку ПЦР амплифицируют регионы ДНК, он может использоваться для анализа чрезвычайно небольших количеств образца. Кроме того, количество времени, необходимое для амплификации ДНК с предоставленным уровня, зависит от ее количества в исходном образце, благодаря чему ПЦР может также использоваться для определения количества ДНК.

Анализ древней ДНК

Используя ПЦР, становится возможным проанализировать ДНК, которой несколько тысяч лет. Методы ПЦР были успешно использованы на некоторых древних животных, например мамонте возрастом в 40 тыс. Лет и на человеческой ДНК с древних гробниц, например, египетских мумий.

Идентификация вирусной ДНК

Вирусные заболевания также могут быть идентифицированы с помощью ПЦР. Используя праймеры, специфичные для данного вируса, ПЦР может успешно амплифицировать ДНК и обнаружить, присутствует в нем вирус. Поскольку ПЦР очень чувствительный, такой анализ часто возможен вскоре после инфекции, которая может произойти от нескольких дней до нескольких месяцев или даже лет до появления фактических симптомов. Такое раннее выявление предоставляют врачам существенную помощь в лечении. Врачи могут также использовать методы количественной оценки ДНК для определения количество вируса («вирусный груз») в пациенте.

Оценка количества ДНК и определения экспрессии генов

Потому что количество продукта, полученного с помощью ПЦР, зависит от количества исходного материала, ПЦР может использоваться для оценки количества копий предоставленной последовательности, которые присутствуют в образце — техника, особенно полезна для определения уровней экспрессии генов. В клетках каждый ген экспрессируется через производство матричной или транспортной РНК (тРНК), которая затем используется для трансляции в белки, соответствующие гена. Количество РНК в клетке для данного гена показывает, насколько ген сейчас активен. Используя обратную транскрипцию для получения ДНК, комплементарной мРНК (кДНК) и впоследствии используя РЛР для амплификаци этих молекул, можно определить уровень экспрессии гена.

Более точные измерения возможны, если количество двухцепочечной ДНК вимирюваеться после каждого цикла ПЦР, метод известен как «количественный ПЦР в реальном времени». К смеси добавляется краситель, который становится флуоресцентным при контакте с ДНК, и количество ДНК может быть определена по интенсивности флуоресценции.

Комментарии и ссылки

  1. а бы Mullis, Kary (1998). Dancing Naked in the Mind Field. New York: Pantheon Books. ISBN 0-679-44255-3.
  2. Rabinow, Paul (1996). Making PCR: A Story of Biotechnology. Chicago: University of Chicago Press. ISBN 0-226-70146-8.
  3. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990; 262 (4): 56-61, 64-5.
  4. Advice on How to Survive the Taq Wars 2: GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Article. May января 2006
  5. Отжиг (англ. Annealing) — гибридизация фрагментов ДНК
  6. Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарна структура
  7. Диммеры праймеров — межмолекулярные структуры, образующиеся праймерами друг с другом или с самим собой

Этапы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Проведение ПЦР в лаборатории

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

  1. Выделение ДНК
  2. Амплификация ДНК-фрагментов
  3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5–2 часа.

Наименование услуги Стоимость
Жидкостная цитология 2 200 руб.
Соскоб на грибы (демодекс) 650 руб.
Анализ мочи общий 350 руб.
Анализ мочи (2-х стаканная проба) 630 руб.
Анализ кала общий (копрограмма) 430 руб.
Смотреть весь прайс-лист

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256… С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *