Афлатоксин

Покупая продукты на рынке или в магазине, мы надеемся на их должное качество. Но неизвестно как хранились орехи, сухофрукты, зерновые культуры, молочные и другие продукты питания. Иногда они могут нести в себе смертельную опасность.

Речь идёт о грибках, поражающих пищу при неправильных условиях содержания. Если на складе или в доме наблюдается повышенная влажность и тепло, то это может привести к возникновению специфической плесени на некоторых видах пищевых продуктов. Плесень эта выделяет афлатоксины — очень ядовитые вещества, которые могут вызвать отравление вплоть до летального исхода.

Афлатоксины в продуктах питания

Афлатоксины — это одна из самых опасных групп ядовитых веществ, выделяемых грибом из рода Aspergillusflavus. При неправильном хранении афлатоксины могут содержаться в следующих продуктах:

Наиболее часто источником афлатоксина является арахис.

микотоксины

К какой группе токсинов относится афлатоксин? Афлатоксины относятся к микотоксинам, то есть к ядам, которые производят плесневые грибы. Самое большое количество афлатоксина бывает в жёлтой плесени. Существует 4 основных вида афлатоксинов — B1, B2, G1, G2. Кроме них есть так называемые метаболиты. Их 10 — M1, M2, B2a, G2a, GM1, P1, Q1 и другие. Афлатоксин B1 содержится в основном в зерне, кофе, чае, какао, орехах, сухофруктах. Они являются наиболее распространёнными и обладают сильными канцерогенными свойствами. А афлатоксин M1 можно встретить в молочных продуктах.

Афлатоксины в чае появляются из-за его неправильного и длительного хранения. Мало кто знает, что чай и кофе, вообще-то, имеют срок годности. Если от заварки пахнет плесенью, то такой напиток лучше не пить. Особенно опасны чаи с ароматизаторами, красителями, так как они могут скрывать плесневый запах.

Афлатоксины в хлебе можно обнаружить, если он был произведён из плохого сырья.

Как действуют афлатоксины

Микотоксины могут попадать в организм человека непосредственно при употреблении пищи, содержащей плесень или через мясо, молоко, яйца отравленных афлатоксинами животных. Основной их мишенью является печень человека. Воздействие происходит на клеточном уровне. Механизм действия афлатоксинов заключается в подавлении синтеза белка. Яды поражают клетки печени, вызывая их гибель или замещая их содержимое жировой тканью. Жировое перерождение печени значительно снижает её функциональность. Если причиной острого отравления стал афлатоксин B1, то поражаться может не только печень, но и сердце, почки, селезёнка. Кроме гибели печёночных клеток, токсины грибов приводят к раку печени.

Афлатоксины обладают не только гепатотоксическим действием. Они оказывают ещё мутагенное, эмбриотоксическое, иммунодепрессантное и тератогенное (вредное для плода) действия.

При употреблении смертельной дозы афлатоксина гибель человека наступает в течение двух суток из-за массовой гибели клеток печени и развития острой печёночной недостаточности. Токсичной дозой афлатоксина считается 1,7 мг/кг, а смертельной — 75 мг/кг.

Афлатоксины в продуктах могут содержаться лишь в определённом количестве. Минимальные дозы установлены СанПиН. Допустимое содержание афлатоксина B1 в орехах и зерновых культурах — 0,005 мг/кг.

В молоке, сыре, яйцах плесневых токсинов должно быть не более 0,0005 мг /кг.

Высокая токсичность этих веществ обуславливает большое количество смертельных исходов в результате отравления.

Но даже если не возникло тяжёлого отравления, при систематическом употреблении афлатоксин действуют на человека следующим образом:

  • нарушают обмен витамина D и снижают прочность костей;
  • уменьшают образование жёлчных солей;
  • замедляют всасывание жиров и пигментных веществ;
  • нарушают обмен минералов (железа, меди, фосфора);
  • снижают иммунитет;
  • у детей вызывают задержку роста и развития.

Симптомы отравления

Афлатоксин начинает действовать на человека уже в течение первых 30 минут. Появляются следующие симптомы:

  • снижение аппетита

    вялость;

  • снижение аппетита;
  • атаксия (некоординированные движения);
  • парезы, параличи;
  • судороги;
  • боли в области печени;
  • диарея;
  • рвота;
  • головная боль;
  • желтуха;
  • отеки;
  • кровоизлияния на коже и слизистых оболочках.

Печень перестаёт выполнять свои основные функции. Кровоизлияния обусловлены нарушением образования белков свёртывающей и противосвертывающей системы. Снижаются все виды обмена. Страдает и выработка иммунных тел, очищение организма от токсинов.

снижение веса

При систематическом употреблении в низких дозах возникают переломы вследствие остеопороза, снижение массы тела, задержка психического и физического развития у детей.

Хронический афлатоксикоз грозит циррозом печени. Если кормящая мать употребляет продукты, заражённые грибами рода Aspergillus, то афлатоксины могут передаваться с её молоком ребёнку. Тогда из-за постоянного низкодозного воздействия у малыша также может развиться цирроз печени. Симптомы цирроза развиваются быстро — в течение 17 дней.

Отдалённым последствием афлатоксикоза является канцерогенез. Если отравление развивается на фоне гепатита B или C, то риск возникновения рака печени увеличивается во много раз. У детей при остром отравлении высокими дозами афлатоксинов очень быстро возникают рвота, судороги и коматозное состояние. До 80% детей с такими симптомами погибают. При остром афлатоксикозе следует немедленно обратиться за медицинской помощью, потому что состояние ухудшается с каждой минутой и тяжёлое необратимое поражение печени и нервной системы наступает быстро.

Общая длительность течения лёгкого или среднетяжёлого отравления 10–15 дней.

Профилактика отравления афлатоксинами

При покупке любых продуктов следует смотреть срок годности. Это касается и чаёв, кофе, какао, орехов. Обратите внимание на санитарные условия, в которых находятся продукты питания. Афлатоксины в орехах и других снеках могут образовываться, если они продаются на открытом рынке. Особенно осенью и в условиях сырости, стоит усомниться в их доброкачественности.

Обратите внимание на запах и цвет продукта. Неприятного запаха и посторонней окраски быть не должно. Если все же существует подозрение, что продукт опасен для здоровья, можно отнести его на экспертизу и взыскать с продавца компенсацию.

Купить качественную пищу мало — нужно ещё и правильно её хранить дома. Для этого подойдёт сухое тёмное помещение с низкой влажностью. Запасы лучше не делать, а покупать свежие орехи в меньшем количестве, но часто. Если на них все же образовалась плесень, её нельзя соскабливать, мыть мылом, жарить и так далее, а затем употреблять продукт. Афлатоксины находятся не только на поверхности продукта в месте образования плесени, и они устойчивы к высоким температурам, мылу и спирту.

Если орехи, сухофрукты, крупы мы можем проверить сами, то как же быть с молочной продукцией? В этом случае, чтобы обезопасить себя, следует приобретать молоко, сыр, творог произведённые престижной компанией, которая не пренебрегает контролем качества. При подозрении на некачественный продукт можно отнести молоко на экспертизу. Определение афлатоксина M1 в молоке делается с помощью специального теста и занимает всего 10 минут.

Детское питание требует особо тщательной проверки, ведь речь идёт о здоровье наших детей.

  1. Тщательно проверьте срок годности на баночках, упаковках.
  2. Перед тем как давать ребёнку питание попробуйте его сами, оцените вкус и запах.
  3. Упаковки из-под каш и молочных смесей должны тщательно проверяться изнутри и снаружи.
  4. Нужно строго соблюдать условия хранения каждого продукта.
  5. Нельзя хранить детское питание в открытом виде дольше, чем предусмотрено производителем.

Канцерогенный эффект афлатоксина снижают следующие продукты:

  • морковь;
  • петрушка;
  • сельдерей.

Поэтому эти продукты должны входить в рацион взрослых и детей.

Подведём итоги. Среди микотоксинов наиболее опасными являются афлатоксины. Они обнаруживаются не только в зерне, орехах, сухофруктах и арахисе, но и в молоке, сыре, твороге, хлебе, мясе, яйцах. Эти токсины оказывают негативное влияние на печень, нервную систему, почки, селезёнку, сердце. Цирроз печени может развиться в короткие сроки как у взрослых, так и у детей. Доказано канцерогенное влияние этих веществ на печень. Первичный рак печени особенно часто является следствием отравления афлатоксинами, если имеется сопутствующий гепатит. Обезопасить себя просто — нужно лишь правильно выбирать и хранить продукты, обращать внимание на срок годности, их цвет и запах, а также употреблять в пищу овощи, снижающие канцерогенный эффект афлатоксинов.

Микотоксикозы — заболевания, обусловленные попаданием в организм микотоксинов, которые образуются в процессе жизнедеятельности ряда микроскопических (плесневых) грибов.

Алиментарные микотоксикозы характеризуются поступлением микотоксинов с пищей.

Источники микотоксинов:

Чаще — растительные продукты. Поражение их грибками происходит в период созревания и уборки урожая при неблагоприятных метеорологических условиях и неправильном хранении. Сельскохозяйственные продукты и корма, пораженные грибками, изменяют свой внешний вид, что помогает установить их недоброкачественность. Такие продукты и корма могут стать причиной тяжелых заболеваний людей и животных вследствие накопления в них микотоксинов.

Могут они накапливаться и в продуктах животного происхождения. Микотоксины накапливаются в тканях и органах животных, у яйценесущих птиц — также в яйцах, из организма лактирующих животных микотоксины, метаболизируясь, выделяются с молоком. Такие продукты представляют наибольшую опасность для здоровья человека, т.к. микотоксины могут присутствовать в них без видимого роста плесени.

Микотоксины устойчивы к действию физических и химических факторов. Поэтому разрушение их в пищевых продуктах представляет трудную задачу. Общепринятые способы технологической и кулинарной обработки лишь частично уменьшают содержание микотоксинов в продукте. Высокая температура (свыше 200°), замораживание, высушивание, воздействие ионизирующего и ультрафиолетового излучения оказались также малоэффективными.

К настоящему времени выделено и идентифицировано более 100 микотоксинов. Многие из них являются высокотоксичными веществами, оказывающими канцерогенное, мутагенное, тератогенное, нейтропное и иное воздействие на организм человека. Наиболее опасными из микотоксикозов являются афлатоксикоз, фузариотоксикоз и эрготизм.

Афлатоксикоз

Афлатоксикоз — пищевое отравление, возникающее при употреблении пищевых продуктов, содержащих афлатоксины.

Продуценты: плесневые грибы Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus.

Характеристики: В настоящее время к афлатоксинам относится 20 соединений. Наибольшую опасность в отношении заражения пищевых продуктов, представляют афлатоксин B1 и афлатоксин M1 (метаболит афлатоксина B1). Очень высокая токсичность!!!

Афлатоксины термостабильны и практически не разрушаются при обычной технологической и кулинарной обработке.

— арахис и арахисовое масло;

— лесные орехи;

— миндаль,

— фисташки;

— грецкий орех;

— кокосовый орех;

— бразильский орех;

— специи, например, различные виды перца, мускатный орех;

— бобы кофе и какао;

— кукуруза;

— рис;

— пшеница;

— масличные семена — например, арахис, соя, подсолнечник, хлопок;

— продукты преобразования афлатоксина иногда обнаруживают в яйцах, молочных продуктах и мясе, когда животные питаются загрязненные зерна.

Условия:

Оптимальные условия для роста аспергилл и токсинообразования: температура 27-30⁰ С, относительная влажность воздуха 97-98 %.

Загрязнение афлатоксинами может происходить при неблагоприятных условиях роста растений, неудовлетворительной сушке и увлажнении урожая при хранении. Наиболее распространены афлотоксикозы в тропических и субтропических странах, где климат способствует росту продуцентов афлатоксина.

Длительная транспортировка этих продуктов в трюмах кораблей при повышенной температуре и влажности увеличивает содержание АТ во много раз.

Поступая в организм сельскохозяйственных животных с загрязненными кормами, афлатоксины типа В трансформируются в аналогичные соединения типа М, которые накапливаются во внут­ренней среде и выделяются с молоком.

Патогенез поражений:

Афлатоксины в организме человека подвергаются внутрикле­точному гидроксилированию монооксигеназной системой с обра­зованием вторичных метаболитов (включая афлотоксин М1 и эпо­ксидные соединения). При недостаточности клеточной защиты, вторичные продукты способны повреждать белковые и нуклеиновые соединения, вызывая сенсибилизацию организма, нарушая функции мембран, повреждая наследственную информацию и инициируя канцерогенез.

Главным органом — мишенью афлатоксинов является печень. Афлатоксины обладают сильным гепатотоксическим и гепатоканцерогенным действием — они вызывают первичный рак печени. При попадании высокой дозы яда в организм смерть может наступить в течение нескольких суток из-за необратимых поражений печени.

Действие на организм:

— Оказывают сильное токсическое воздействие на печень, а высоких концентрациях могут привести а летальному исходув течение нескольких суток из-за острого поражения клеток печени;

— Вызывают печеночный некроз, при хронической интоксикации — цирроз и карциноме печени;

— Нарушают метаболизм витамина Д, тем самым снижая прочность костей;

— Снижают образования желчных солей:

— Ухудшают всасывание жиров и пигментов;

— Снижают метаболизм минералов, включая железо, фосфор и медь;

— Угнетают иммунную систему;

— Вызывают задержку роста и развития у детей;

Симптомы:

1.Острое отравление афлатоксинами проявляется ярко выраженными симптомами уже в течение получаса после употребления заражённой пищи.

Основные из них:

— головная боль;

— вялость, слабость;

— боль в области печени;

— появление судорог;

— парезы;

— нарушение координации движений;

— снижение аппетита;

— нарушение ф-ций ЖКТ;

— геморрагии;

— отеки.

2.Регулярное попадание в организм продуктов жизнедеятельности плесневых грибков в незначительных дозах вызывает хронический афлатоксикоз, который с высокой долей вероятности приводит к развитию рака печени. Поэтому так важны меры предосторожности при выборе и хранении продуктов питания.

Лечение:

Отравление требует немедленной квалифицированной медицинской помощи, поскольку может привести к тяжёлым поражениям печени и нервной системы. Попадание яда в организм ребёнка способно привести к летальному исходу из-за высокой чувствительности детского организма к действию этого токсина.

Профилактика:

Основные меры профилактики афлатоксикозов — правильное хранение зерна, предупреждение плесневения продуктов питания, систематический контроль продуктов и кормов на загрязнение афлатоксинами. Норма безопасной суточной дозой для человека с массой тела 60 кг считается не более 0,3 – 0,6 мкг афлатоксина.

Stylab / Каталог / Микотоксины / Афлaтoксины

Компания СТАЙЛАБ предлагает системы экспресс-анализа (тест-карточки, полоски и колонки), тест-системы для ИФА и иммуноаффинные колонки для пробоподготовки, а также сухие стандарты и стандартные растворы афлатоксинов.

Иммуноферментный метод анализа (ИФА), стрипованный планшет R4701 RIDASCREEN ® Aflatoxin Total
Иммуноаффинная очистка, колонки для пробоподготовки RBRRP71/RBRRP70N EASI-EXTRACT ® Aflatoxin
Твердофазная очистка, колонки для пробоподготовки P25 PuriTox Aflatoxin
Иммунохроматографический метод анализа, тест-полоски R5204 RIDA ® QUICK Aflatoxin
Иммунохроматографический метод анализа, тест-карточки RBRP27 AFLACARD ® B1
Стандартные растворы TSL-104-10 Trilogy ® Liquid Aflatoxin B-1
Сухие стандарты TS-104-10 Trilogy ® Dry Aflatoxin B-1

Афлатоксины — высокотоксичные соединения, выделяемые некоторыми видами плесневых грибов рода Aspergillus. Представители этого рода выглядят как скопления тонких белых нитей, которые в дальнейшем (при созревании спор) могут изменить окраску. В настоящее время известно 18 типов этих ядовитых веществ. Особенно распространены афлатоксины B1, B2, G1 и G2, а также M1 – метаболит афлатоксина B1. Аспергиллы, выделяющие эти вещества, лучше всего развиваются в тропическом и субтропическом климате. Основные виды рода Aspergillus, выделяющие афлатоксины, – A. parasiticus и A. flavus, от названия которого и образован термин. Афлатоксины обнаруживаются в арахисе и прочих масличных культурах — сое, подсолнечнике, хлопковом семени. Кроме того, заражены могут быть и другие продукты:

Афлатоксины практически не разрушаются при нагревании, и продукты, содержащие их, опасны даже после тепловой обработки.

В 1960-х годах в Англии от так называемого «заболевания X» погибло более ста тысяч индеек и других сельскохозяйственных животных. Заболевшие животные были вялыми, теряли аппетит и гибли в течение недели. Кожа и яичный желток больных птиц была слабо пигментирована — это явление получило название «синдром бледной птицы». Похожие симптомы можно наблюдать при отравлении охратоксином A. На тушках погибших птиц обнаруживали специфические кровоподтеки и синяки. Причиной болезни оказались афлатоксины, которые содержались в кормовом арахисе, зараженном A. flavus. Среди домашних питомцев к афлатоксинам наиболее чувствительны кролики, а среди птиц — утки, чуть менее — индейки, бройлеры, куры-несушки и перепела. Свиньи больше подвержены отравлениям афлатоксинами, чем жвачные животные. В рубце жвачных эти вещества частично разрушаются, что, впрочем, лишь незначительно уменьшает опасность. При остром афлатоксикозе у скота нарушается координация движений, становится грубой шерсть, животные впадают в летаргическое состояние. Афлатоксины опасны и для рыб, причем особенно уязвима радужная форель. Экономический вред афлатоксинов выражается в ухудшении конверсии и усваиваемости корма, снижении темпов роста и продуктивности животных и в их гибели.

Афлатоксины увеличивают хрупкость капилляров и снижают свертываемость крови. Промежуточные метаболиты афлатоксинов способны вызывать нарушения работы печени и почек, снижение иммунитета. Взаимодействие этих веществ с нуклеотидами нарушает структуру ДНК, что может приводить к гибели клеток или их преобразованию в опухолевые. В частности, установлена связь афлатоксинов с развитием гепатоцеллюлярной карциномы человека. Наибольшей канцерогенностью и токсичностью обладает афлатоксин B1: его LD50 варьирует от 0.3 мг/кг для кроликов до 17.9 мг/кг у самок крыс. Помимо того, что этот микотоксин опасен сам по себе, в организме животных из него образуется афлатоксин M1.

Афлатоксин M1 обнаруживается в молоке в количестве 1–6% от процентного содержания афлатоксина B1 в корме. Токсичность афлатоксина M1 до сих пор недостаточно хорошо изучена, что связано с трудностями выделения достаточного для анализа количества токсина. Однако известно, что афлатоксин M1 обладает выраженным гепатотоксическим и генотоксическим эффектом, его LD50 для утят составляет 0.8 мг/кг. Кроме того, существуют данные о канцерогенной и мутагенной активности афлатоксина M1, хотя она значительно ниже, чем у афлатоксина B1. Афлатоксин M1 может содержаться не только в молоке, но и в молочных продуктах, в том числе прошедших пастеризацию и ультрапастеризацию.

Технические регламенты Таможенного союза №№ 015/2011 «О безопасности зерна» и 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» устанавливают максимально допустимое содержание афлатоксина B1 в пищевых злаках, бобовых, масличных культурах и продуктах из этих культур, в кондитерских изделиях, жевательной резинке, какао-бобах, какао-продуктах и шоколаде, а также в орехах, чае, кофе и масложировой продукции на уровне 5 мкг/кг. В ферментных молокосвертывающих препаратах грибного происхождения, продуктах для детей, беременных и кормящих женщин присутствие афлатоксина B1 не допускается (не более 0,15 мкг/кг).

Допустимое содержание афлатоксина M1 отдельно регулируется техническими регламентами Таможенного союза №№ 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» и составляет 0,5 мкг/кг в молоке, продуктах его переработки и биологически активных добавках на основе переработки молочного сырья. Присутствие афлатоксина M1 в продуктах для детей, беременных и кормящих женщин не допускается (менее 0,02 мкг/кг). С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com.

Для анализа содержания афлатоксинов в пробах продуктов, включая и определение афлатоксина М1 в молоке, используются хроматографические методы (высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография) и метод иммуноферментного анализа — наиболее удобный и практичный из перечисленных. Предлагаемые СТАЙЛАБ методики определения афлатоксинов путем ИФА отличаются очень высокой чувствительностью, позволяя выявлять присутствие афлатоксина B1 на уровне 1 мкг/кг, а афлатоксина M1 — 5–50 нг/л. Упростить процедуру подготовки проб и повысить чувствительность метода ВЭЖХ можно с помощью иммуноаффинных колонок.

Литература

Определение микотоксинов

←Вернуться

ГОСТ 31748-2012
(ISO 16050:2003)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение афлатоксина и общего содержания афлатоксинов , , и в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматогр

фии

МКС 67.060
67.080.10

Дата введения 2013-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 октября 2012 г. N 51)
За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны по
МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Казахстан

KZ

Госстандарт Республики Казахстан

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Россия

RU

Росстандарт

Таджикистан

TJ

Таджикстандарт

Узбекистан

Узстандарт

(Поправка. ИУС N 7-2015), (Поправка. ИУС N 6-2019).

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1760-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31748-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 16050:2003* Foodstuffs — Determination of aflatoxin , and the total content of aflatoxins , , and in cereals, nuts and derived products — High-performance liquid chromatographic method (Продукты пищевые. Определение афлатоксина и общего содержания афлатоксинов , , и в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта, выделены курсивом.
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. — Примечание изготовителя базы данных.
Международный стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).
Перевод с английского языка (en).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.
Степень соответствия — модифицированная (MOD).
Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53162-2008 (ИСО 16050:2003)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
ВНЕСЕНЫ: поправка, опубликованная в ИУС N 2, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 7, 2015 год; поправка, опубликованная в ИУС N 6, 2019 год с учетом уточнения, опубликованного в ИУС 11-2019

Поправки внесены изготовителем базы данных

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой, с очисткой на иммуноафинной колонке и послеколоночной дериватизацией, для определения афлатоксинов в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки.
Предел количественного определения афлатоксина и суммы афлатоксинов , , и — 8 мкг/кг.
Данный метод применим в отношении кукурузы с содержанием 24,5 мкг/кг, арахисового масла с содержанием 8,4 мкг/кг и сырых арахисовых орехов с содержанием 16 мкг/кг общей суммы афлатоксинов.
Метод допускается использовать для масличных культур, сушеных фруктов и продуктов их переработки.

2 Нормативные ссылки

ГОСТ 4159-79 Реактивы. Йод. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 22524-77 Пикнометры стеклянные. Технические условия
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
(Поправка. ИУС N 2-2015)

3 Сущность метода

* Наименование раздела 3 в оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Анализируемый образец экстрагируют смесью метанола и воды. Экстракт образца фильтруют, разбавляют водой и вводят в колонку для аффинной хроматографии, содержащую антитела, специфичные для афлатоксинов , , и . Афлатоксины выделяют, очищают и концентрируют на колонке, после чего отделяют от антител при помощи метанола. Афлатоксины определяют количественно при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой с определением флуоресценции и послеколоночной дериватизацией.

4 Реактивы

При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок квалификации х.ч. или ч.д.а.

4.1 Вода, не ниже 1-й степени, по .
Вода не должна содержать органические примеси.

4.2 Хлорид натрия по ГОСТ 4233.

4.3 Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

4.4 Афлатоксин, кристаллический или в виде пленочной ампулы.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Афлатоксины канцерогенны для человека. Следует принимать во внимание заявление, сделанное Международным агентствами по исследованиям в области рака (ВОЗ) (см. , ).
Необходимо надлежащим образом предохранять лабораторию, в которой проводятся анализы, от дневного света. Для этого закрывают окна фольгой, поглощающей ультрафиолетовое излучение. Допускается использовать в комбинации с затемненным освещением (когда отсутствует прямое солнечное освещение) занавески или шторы в комбинации с искусственным освещением.

4.5 Ацетонитрил, степень чистоты для ВЭЖХ.

4.6 Метанол по ГОСТ 6995, степень чистоты ВЭЖХ.

А.7 Толуол по ГОСТ 5789.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Толуол огнеопасен и токсичен. Приготовление стандартов с использованием данного растворителя следует проводить в вытяжном шкафу. Операции за пределами вытяжного шкафа, такие как измерение эталонов методом УФ спектрометрии, следует проводить с использованием эталонов в закрытых контейнерах.

4.9 Растворитель для экстракции
Смешивают семь объемных частей метанола (4.6) с тремя объемными частями воды (4.1).
Другие смеси — растворители для экстракции, которые совместимы с подвижной фазой, могут также использоваться, если покажут себя более эффективными или будут рекомендованы производителем иммуноаффинной колонки.

4.10 Подвижная фаза
Смешивают три объемные части воды (4.1) с одной объемной частью ацетонитрила (4.5) и одной объемной частью метанола (4.6). Перед использованием проводят дегазацию раствора.

4.11 Реагент для послеколоночной дериватизации
Растворяют 100 мг йода (4.3) в 2 см метанола (4.6). Добавляют 200 см воды (4.1), перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.8). Раствор готовят на неделю использования и хранят в темноте или в склянке из коричневого стекла. Перед использованием раствор встряхивают в течение 10 мин.

4.12 Основные стандартные растворы афлатоксинов , , и
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Растворы, содержащие афлатоксины, предохраняют от действия света (хранят в темноте, используют алюминиевую фольгу или затемненную стеклянную посуду).
Афлатоксины , , и растворяют по отдельности в смеси толуол/ацетонитрил (4.8), для получения индивидуальных растворов с массовой концентрацией вещества 10 мкг/см.
Для определения точной концентрации афлатоксина в каждом исходном растворе регистрируют спектр поглощения при длинах волн от 330 до 370 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см (5.7), используя спектрометр (5.6).
Рассчитывают концентрацию каждого афлатоксина , мкг/см, используя уравнение (1):

, (1)

где — оптическая плотность, определяемая в максимуме спектра поглощения;
— молекулярная масса каждого афлатоксина, г/моль;
— коэффициент молярного поглощения каждого афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил.
Примечание — Это значение определено для раствора, который содержит 1 моль/дм афлатоксина и находится в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Коэффициент молярного поглощения () применяют без единиц измерения, допускается применять уравнение , ему соответствует единица измерений: дм·моль·см;
— длина оптического пути кюветы, см.
и приведены в таблице 1.
Таблица 1 — Молекулярные массы и коэффициенты молярного поглощения афлатоксинов , , и

Афлатоксин

, г/моль

Примечание — В качестве растворителя используется смесь толуола и ацетонитрила (4.8)

4.13 Основной стандартный раствор смеси афлатоксинов
Готовят исходный раствор, содержащий 500 нг/см афлатоксина , 125 нг/см афлатоксина , 250 нг/см афлатоксина и 125 нг/см афлатоксина в смеси толуол/ацетонитрил (4.8). При необходимости хранения раствора взвешивают колбу. Колбу плотно оборачивают алюминиевой фольгой и хранят при температуре около 4 °С. Непосредственно перед использованием колбу взвешивают снова и отмечают любые изменения в массе после хранения.
Примечание — Обычное воздействие УФ излучения во время измерения оптической плотности не приводит к заметной конверсии с образованием продуктов фотолиза.

4.14 Градуировочный раствор смеси афлатоксинов
Каждую порцию основного стандартного раствора смеси афлатоксинов (4.13), как это указано в таблице 2, переносят в четыре мерные колбы вместимостью 2 см (5.5). Растворы выпаривают до сухого остатка в токе азота при комнатной температуре. В каждую колбу добавляют 1 см метанола (4.6). Растворяют в нем сухой остаток, разбавляют раствор до метки водой (4.1) и перемешивают. Растворы готовят непосредственно в день использования.
Таблица 2 — Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор

Объем, отобранный из исходного раствора, мкл

Концентрация афлатоксина, нг/см

1

15,0

3,75

7,50

3,75

2

10,0

2,50

5,00

2,50

3

5,00

1,25

2,50

1,25

4

2,50

0,625

1,25

0,625

Примечание — Указанные значения приведены в качестве ориентиров. Точные значения массовой концентрации растворов вычисляют исходя из значений, рассчитанных по формуле (1) — см. 4.12

4.15 Серная кислота, по ГОСТ 4204, раствор ()=2 моль/дм.

5 Оборудование

Лабораторную стеклянную посуду, которая контактирует с водными растворами афлатоксинов в серной кислоте (4.15), погружают в воду на несколько часов, затем тщательно промывают (например, три раза) водой, чтобы удалить все следы кислоты. Отсутствие кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.
Примечание — Данная обработка является необходимой, так как использование стеклянной посуды, промытой не кислотой, может привести к потере афлатоксинов. На практике данная обработка необходима для круглодонных колб, мерных колб, мерных цилиндров, склянок или пробирок, используемых для градуировочных растворов и конечных экстрактов (особенно автоматических пипеток), а также пастеровских пипеток, если они используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, то, которое приводится ниже.

5.1 Иммуноаффинная (IA) колонка

IA колонка содержит антитела, предназначенные для афлатоксинов , , и . Колонка должна иметь минимальную емкость не менее 100 нг афлатоксина и должна давать выход не менее 80% для афлатоксинов , и и не менее 60% для афлатоксина при внесении в колонку 15 см градуировочного раствора, содержащего 5 нг каждого афлатоксина в смеси метанол/вода . Колонка должна быть оборудована подходящей емкостью для растворителя (например шприцем с переходной насадкой).

5.2 Блендер, с баком смесителя на 500 см и крышкой.
Рекомендуется использование высокоскоростного блендера.

5.3 Рифленая фильтровальная бумага, например, диаметром 24 см.

5.4 Фильтровальная бумага из стеклянного микроволокна, например, диаметром 11 см.

5.5 Мерные колбы по ГОСТ 1770, вместимостью 2 см или пикнометры по ГОСТ 22524
Примечание — При использовании пикнометров рекомендуется измерять фактическое значение вместимости и использовать его при обработке результатов измерений в качестве величины

5.6 Спектрофотометр, предназначенный для измерения оптической плотности в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм.

5.7 Кюветы из кварцевого стекла толщиной 1 см, не имеющие существенного поглощения в диапазоне длин волн от 300 до 370 нм.

5.8 Мембранный фильтр для водных растворов, изготовленный из политетрафторэтилена, диаметром 4 мм и размером пор 0,45 мкм.

5.9 Оборудование для ВЭЖХ

5.9.1 Насос ВЭЖХ, способный производить скорость потока 1 см/мин.

5.9.2 Система ввода (инжектор), со шприцевой загрузкой и петлей 50 мкл или эквивалентным.

5.9.3 Аналитическая разделяющая колонка с обращенной фазой, например , которая обеспечивает разрешение пиков афлатоксинов , , и до базовой линии от всех остальных пиков и которая имеет следующие характеристики:
— длина: 250 мм;
— внутренний диаметр: 4,6 мм;
— размер сферических частиц: 5 мкм.
Допускается использование колонки меньшей длины.

5.9.4 Система послеколоночной дериватизации, состоящая из безпульсационного насоса и тройника, имеющего очень малый мертвый объем, системы труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали длиной от 3000 до 5000 мм и внутренним диаметром 0,5 мм, а также водяной бани или послеколоночного реактора для реакции с участием йода.

5.10 Флуоресцентный детектор, пригодный для работы при длине волны возбуждения 365 нм и излучении при длине волны эмиссии 435 нм (для фильтровых приборов длина волны регистрации излучения >400 нм), с пределом детектирования не более 0,05 нг афлатоксина в объеме ввода (в данном случае он равен 50 мкл).

6 Методика испытания

* Наименование раздела 6 в оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.

6.1 Общие замечания
Растворы проб и стандартные растворы для определения с помощью ВЭЖХ должны содержать одинаковый растворитель или смесь растворителей.

6.2 Экстракция
Взвешивают 25 г гомогенизированной пробы, с точностью 0,1 г в сосуде блендера (см. 5.2). Добавляют 5 г хлорида натрия (см. 4.2) и 125 см растворителя для экстракции (см. 4.10) и гомогенизируют с помощью перемешивающего устройства в течение 2 мин при высокой скорости. Контролируют, чтобы время и скорость перемешивания не оказывали негативного влияния на эффективность экстракции. Смесь фильтруют через рифленую фильтровальную бумагу (см. 5.3) ().
Отбирают пипеткой 15 см () фильтрата в коническую колбу подходящего размера со стеклянной пробкой. Добавляют 30 см воды, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Перед проведением аффинной колоночной хроматографии разбавленный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу из стеклянного микроволокна (5.4). Фильтрат () должен быть прозрачным. Если это не так, проводят повторную фильтрацию. Незамедлительно следуют процедурам в соответствии с 6.3.
Для получения прозрачного раствора можно также использовать центрифугу.

6.3 Очистка
Готовят IA колонку (см. 5.1) и осуществляют процедуру очистки в соответствии с инструкциями производителя. Отбирают пипеткой 15 см () второго фильтрата () в емкость для растворителя IA колонки. Пропускают его через разделяющую колонку, затем промывают колонку, как это описано в инструкциях производителя и удаляют элюаты. Начинают проводить элюирование афлатоксинов. Собирают этанольный или ацетонитрильный элюат (в зависимости от продукта или инструкций производителя) в мерной колбе вместимостью 2 см (см. 5.5) (или другого объема, установленного производителем). Разбавляют до метки водой (). Перемешивают и действуют в соответствии с 6.4.
Методы ввода в IA колонки, промывания и элюирования немного отличаются в зависимости от производителя колонки, и необходимо четко следовать конкретным инструкциям, прилагаемым к колонкам.
Примечание — В целом, процедуры включают экстракцию образца смесью метанола и воды, фильтрацию или центрифугирование, возможное разбавление образца раствором фосфатного буфера или водой, загрузку под давлением в предварительно промытую колонку, промывку колонки дистиллированной водой и элюирование афлатоксинов метанолом или ацетонитрилом (в зависимости от продукта и инструкций производителя).
Допускается использовать традиционные колонки с силикагелем или колонки твердофазной экстракции. В этих случаях также необходимо четко следовать инструкциям производителя. Если растворитель, применяемый для элюирования афлатоксинов, не совместим с подвижной фазой, то элюат необходимо выпарить до сухого остатка в токе азота при температуре ниже 40 °С. Остаток необходимо растворить в подвижной фазе и разбавить до 2 см или до того объема, который установлен производителем.
Необходимо предусмотреть, чтобы максимальная емкость колонки не была превышена.

6.4 Условия работы при выполнении ВЭЖХ
Выход разделительной колонки подсоединяют к одному ответвлению тройника системы послеколоночной дериватизации (5.9.4) с помощью короткого фрагмента системы труб с внутренним диаметром, например, 0,25 мм. Ко второму ответвлению тройника подсоединяют выход насоса, который поставляет реагент для послеколоночной дериватизации. Один конец витка труб из политетрафторэтилена или нержавеющей стали (см. 5.9.4) присоединяют к третьему ответвлению тройника и другой конец присоединяют к детектору (см. 5.10). Используя термостат или водяную баню, поддерживают температуру реакционного змеевика на уровне 70 °С.
В случае использования колонки, указанной в 5.9.3, подходящими являются следующие параметры:
— скорость потока подвижной фазы (колонка): 1,0 см/мин;
— скорость потока послеколоночного реагента: 0,3 см/мин;
— впрыскиваемый объем: 50 мкл.
Дают всей системе функционировать 10-20 мин для ее стабилизации. Если используется интегратор, настраивают регулировку чувствительности флуоресцентного детектора или интегратора, чтобы получить соответствующий сигнал : шум 5:1 для 0,125 нг афлатоксина в 50 мкл. Если используется регистрирующий прибор с ленточной диаграммой, настраивают регулировку флуоресцентного детектора таким образом, чтобы получить для 0,125 нг афлатоксина в 50 мкл от 30% до 40% шкалы регистрирующего прибора.

6.5 Идентификация
Проводят идентификацию каждого пика афлатоксина на хроматограмме образца путем сравнения значений времени удерживания со значениями соответствующих стандартов.
Афлатоксины можно идентифицировать одновременным вводом раствора испытуемой пробы и градуировочных растворов. Кроме того, при идентификации помогает исчезновение пиков афлатоксинов и в случае, когда не проводится добавка реагента для дериватизации.

6.6 Построение градуировочной зависимости
Для каждого афлатоксина строят градуировочную зависимость путем ввода 50 мкл стандартных растворов 1, 2, 3 и 4 (см. таблицу 2). Проверяют линейность зависимости .

6.7 Определение
Количественное определение проводится методом внешнего стандарта с интегрированием площади пика или измерением высоты пика, которые далее соотносятся с соответствующими значениями для стандарта.
В петлю инжектора вводят 50 мкл стандартного раствора в соответствии с инструкциями производителя инжектора. Афлатоксины элюируют в порядке , , и с временем удерживания приблизительно 6, 8, 9 и 11 мин соответственно. Пики должны быть разделены до базовой линии. При необходимости регулируют значения времени удерживания путем изменения концентрации метанола подвижной фазы (4.11).
Вводят 50 мкл () очищенного экстракта образца (см. 6.3) в инжекторную петлю.

7 Обработка результатов

* Слово «Обработка» в наименовании раздела 7 в оригинале выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.
Рассчитывают массу *, г, анализируемой пробы, присутствующей во фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки (), по формуле

, (2)*

, (3)

где — объем элюата (6.3), мкл (2000 мкл);
— объем очищенного и введенного экстракта образца (6.7), мкл (50 мкл);
— масса данного афлатоксина, присутствующего в введенном объеме, соответствующая измеренной площади пика или высоте пика, определяемая по градуировочной характеристике, в нанограммах;
— масса анализируемой пробы, г, соответствующей фракции второго фильтрата, взятого для IA колонки () (см. формулу (2)).
Для получения массовой доли суммы афлатоксинов суммируют массовые доли четырех афлатоксинов.

8 Прецизионность

8.1 Межлабораторное сравнительное испытание
Детали межлабораторного сравнительного испытания прецизионности данного метода приведены в приложении А. Значения, полученные в результате межлабораторного сравнительного испытания, могут быть неприменимы к диапазонам концентраций и матрицам, отличных от тех, которые приведены в приложении А.

8.2 Повторяемость
Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одного и того же метода, идентичных материалов для испытаний в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием того же оборудования в течение короткого интервала времени, будет превышать предел повторяемости , значения которого приведены ниже, не более чем в 5% случаев.

8.3 Воспроизводимость
Абсолютная разница между двумя отдельными результатами испытаний, полученными при использовании одинакового метода, идентичных материалов для испытаний в различных лабораториях различными операторами и с использованием различного оборудования, будет превышать предел воспроизводимости , значения которого приводятся ниже, не более чем в 5% случаев.

9 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать:
— всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
— используемый метод отбора образцов, если он известен;
— используемый метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;
— детали проведения работ, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, а также все факторы, влияющие на результат(ы) испытаний;
— полученные результат(ы) испытаний или, если была проведена проверка повторяемости, полученный окончательный результат.

Приложение А (справочное). Результаты межлабораторного сравнительного испытания

Приложение А
(справочное)

Нижеприведенные данные получены в процессе межлабораторного сравнительного испытания, которое проводилось в 1999 г. и было организовано АОАС и ИЮПАК (Международный союз теоретической и прикладной химии) в соответствии с ГОСТ ISO 5725-1. Были исследованы образцы кукурузы, арахисовых орехов и арахисового масла, имеющие естественное загрязнение и зафиксированные на уровне 10, 20 и 30 мкг/кг общей суммы афлатоксинов с соотношением афлатоксинов , , и — 7:1:3:1 соответственно.
В исследовании участвовало десять лабораторий, имелся один экземпляр каждого образца. Во время проведения данного межлабораторного сравнительного испытания в качестве реагента послеколоночной дериватизации использовался йод.
Таблица А.1 — Данные по прецизионности и открываемости афлатоксина для кукурузы

Параметр

Афлатоксин

Сумма

Число лабораторий, оставшихся после исключения лабораторий с резко отличающимися результатами

Число принятых результатов

Среднее значение , мкг/кг

5,26

0,58

2,34

0,24

8,42

Стандартное отклонение сходимости , мкг/кг

0,78

0,12

0,55

0,19

1,45

Коэффициент вариации сходимости, %

14,9

Предел сходимости (), мкг/кг

2,2

0,34

1,54

0,53

4,06

Стандартное отклонение воспроизводимости , мкг/кг

1,56

0,22

0,71

0,24

2,54

Коэффициент вариации воспроизводимости, %

Предел воспроизводимости (), мкг/кг

4,37

0,62

1,99

0,67

7,11

Выход, %

Таблица А.3 — Данные по прецизионности и открываемости афлатоксина для арахиса

Библиография

Редакция документа с учетом
изменений и дополнений подготовлена
АО «Кодекс»

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *